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线粒体复合体ⅱ试剂盒说明书(可见分光光度法)
点击次数:72 发布时间:2019-10-14

货号:YJ2445                                                    规格:25管/24样

线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基 FAD 还原为 FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。

测定原理

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:0.5 mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂七:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选

做)。

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅱ酶活性测定。

测定步骤:

1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配制:临用前把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺乳

动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂 4℃可保存一周;

(2)在1mL 玻璃比色皿中加入40μL样本、100μL试剂七和800μL工作液,立即混匀,记录 605nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计算 ΔA=A1-A2。

复合体Ⅱ活力单位的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T

=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=113×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.226×ΔA

V 反总:反应体系总体积,9。4×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2。1×104L/mol /cm;

d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;

T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细

菌总数,500 万。

 

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