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线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书(可见分光光度法)
点击次数:41 发布时间:2019-10-22

货号:YJ2445                                                     规格:25管/24样

线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

线粒体复合体Ⅲ(EC1。10。2。2) 又称 CoQ-细胞色素C还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责把还原型 CoQ 的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C。

测定原理

与氧化型细胞色素C不同,还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:0。5 mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂六:液体 2。5mL×1 瓶,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0。1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g,4℃离心 5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ(此步可选

做)。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 550nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或

25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂 4℃可保存一周;

(2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、100μL 试剂六和 800μL 工作液,立即混匀,

记录 550nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

复合体Ⅲ活力单位的计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)

÷T=124×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0。248×ΔA

V 反总:反应体系总体积,9.4×10-4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1。91×104L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0。04 mL;V 样总:加入提取液体积,0。202 mL;

T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

 


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