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葡萄糖含量试剂盒说明书(测组织、细菌或细胞)
点击次数:41 发布时间:2019-10-22

葡萄糖含量试剂盒说明书(测组织、细菌或细胞)

 

分光光度法 50 管/48

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:

葡萄糖不仅是细胞能量代谢的主要底物,而且其代谢中间产物是生物合成的重要底物。植物可通过光合作用产生葡萄糖。就哺乳动物而言,葡萄糖不仅是大脑神经系统、肌肉、脂肪组织等的唯yi能源,而且与还原性辅酶、乳糖和乳脂的合成密切相关。

测定原理:

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并产生过氧化氢;过氧化物酶催化过氧化氢氧化

4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵和蒸馏水

试剂的组成和配制:

试剂一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 25ml×1 瓶,4℃保存;

试剂三:液体 25ml×1 瓶,4℃保存;

葡萄糖提取:

1、组织的处理:按照组织质量g:蒸馏水体积(mL) 15~10 的比例建议称取约 0.1g组织,加入 1mL 蒸馏水,研磨成匀浆,95℃水浴 10 分钟盖紧,防止水分散失,冷却后, 8000g25℃离心 10min,取上清液备用。

2、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量104 :蒸馏水体积mL 500~10001 的比例建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏水超声波破碎细菌或细胞冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复 30 ,95℃水浴 10 分钟盖紧,防止水分散失,冷却后,8000g,25℃离心 10min,取上清液备用。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。

2、混合试剂的配制:使用前将试剂二和试剂三 1:1 等体积混合,用多少配多少。

3、加样表 EP 管中加入下列试剂

试剂(μL

空白管

标准管

测定管

样本

 

 

100

试剂一

 

100

 

蒸馏水

100

 

 

混合试剂

900

900

900

混匀,置 37℃(哺乳动物25℃(其它物种水浴中,保温 15min,于505nm 波长处读取吸光度。空白管、标准管和测定管吸光值分别记为A1A2 A3。空白管和标准管只要做一管。

葡萄糖含量计算:

1、按样本蛋白浓度计算

葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷Cpr

2、按样本鲜重计算

 

葡萄糖含量(µmol/g 鲜重)= (C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0。5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷W

3、按细菌或细胞密度计算

葡萄糖含量(µmol/ 104 cell)= (C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0。001×(A3-A1)÷ (A2-A1)

C 标准:标准管浓度,0.5µmol/mLV1:加入样本体积,0.1mLV2:加入提取液体积,1mL

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g500:细菌或细胞总数,500 万。

 

注意:最低检测限为 50nmol/g 鲜重或 0.5nmol/mg prot

 



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