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pBM16A Toposmart Cloning Kit
点击次数:155 发布时间:2020-02-11

pBM16A Toposmart Cloning Kit

 

 

产品信息:

 

组 成

YCL071-01

YCL071-02

pBM16A Vector (20ng/ml )

20ml

20ml×3

10×Toposmart

20ml

20ml×3

Control Insert

5ml

5ml

M13F Primer

0.1OD

0.1OD×3

M13R Primer

0.1OD

0.1OD×3

保存条件:-20℃保存,有效期一年。产品介绍:

pBM16A Toposmart克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。不仅适用于克隆由PfuKODXeroxPhusion Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物,也可克隆由TaqTthklenTaqDNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。试剂盒中的pBM16A载体为线性化的质粒。可以用引物对M13FM13R进行菌落PCR鉴定阳性克隆。

产品特点:

1连接反应仅需 5 分钟。

2适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。

3载体采用了新的制备工艺,无需蓝白斑筛选

  1. 克隆位点两旁都有Smal和EcoR V酶切位点,适合单酶切鉴定。
  2. 载体具有氨苄青霉素抗性。

操作步骤:

1. 连接反应

按下表,在一个 0.2ml PCR 管中依次加入

成分

体积

DNA --片段

0.5-8µl

pBM16A Topo载体

1ml

10×Toposmart

1ml

补水至总体积

10ml

 加完试剂后,轻轻混匀低速离心,使溶液集中在管底。

注意:此步骤不要在低温条件下(冰水浴)上操作。

 

2. 反应温度及片段要求

室温下20-30℃)放置 0-5 分钟,然后将离心管放置在冰上。如当天不进行转化实验。请将连接产物置于-20℃保存。

注意:DNA-- 片段的用量见下表

 

片段大小(bp

建议用量(ng

100-1000

20-50

1000-2000

50-100

2000-5000

100-200

 

室温下20-30℃)反应时间 5-30 分钟,如果室温较低,推荐使用 PCR 仪器控制温度。可以设置 25℃反应 5 分钟。如果 PCR 产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带,无引物二聚体和非特异性条带存在,可直接取 0.5-1µl PCR 产物原液进行克隆。

3. 阳性对照反应

1µl 试剂盒提供的 1kb 长度的对照片段 LacZ 基因α肽片段进行克隆,转化具有α 互补功能的大肠杆菌感受态细胞(DH5α,TOP10,Mach1-T1 。菌液涂布在含有IPTG,X-gal LB 氨苄平板上,次日蓝色菌落为阳性克隆,说明有片段插入,白色菌落为空载体。

4. 转化

1.5µl 连接产物到 50-100µl 刚刚融化的感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴 2-30 分钟。

2.42℃水浴中热击 30 秒钟。

3. 立刻置于冰水浴中 2 分钟。

加入 300-500µl 无菌的不含抗生素的 SOC LB37℃,200-250rpm 振荡培养 60 钟。

注:小于 2kb 片段可以不复苏,直接涂平板。

  • 吸取 200µl 菌液涂布。为了得到更多的菌落,可以先 4000rpm 离心 1 分钟,去掉部分上清,用移液器轻吹菌体,充分悬浮菌液,取全部菌液涂布,然后 37℃培养过夜12-16 小时

5. 阳性重组子的鉴定菌落 PCR

(1) 菌落PCR方法鉴定阳性克隆

① 用10ml吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中,吹打混合。

25ml PCR反应体系:取2μl细菌悬液为模板、加入5μM 浓度的M13F/M13R

1μl进行PCR扩增。

PCR扩增条件:95℃预变性5分钟(裂解细胞,失活核酸酶),94℃变性10钟,55℃退火10秒钟,72℃延伸 根据片段的大小决定延伸时间,通常每1min/1kbX秒,30个循环,72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,有强烈的明显条带的克隆为重组体,与插入片段大小相近M13F/M13R 引物在克隆位置的两侧,所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大138bp可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。

(2) 测序:用M13FM13R通用引物对阳性质粒进行测序分析。

pBM16A载体图谱

 

 
 

常见问题分析

 

重组子克隆菌少,或阳性率低:

(1) 感受态效率低,使用转化效率>5×107cfu/µg 的感受态细胞

(2) 连接反应在低温下(如放碎冰上)操作,应该在室温下操作。

(3) PCR 片段加入量太多或太少,按照推荐量加入。

(4) PCR 纯度低,重新扩增或重新纯化PCR 产物。

(5) PCR 质量低,切胶时在紫外下照射时间长,需重新制备。

(6) PCR 扩增结束后,应该再延伸 5-10 分钟,确保片段延伸完全。

(7) 转化后没有复苏培养,可以加入 SOC LB,培养 60 分钟。

  • 克隆基因可能对宿主菌有毒性,比如某些编码膜蛋白和 DNA 结合蛋白的基因, 某些启动子和调节序列基因,或含有倒置或串联重复序列的基因,选用室温过夜培养平板。

 

载体序列:

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

本产品仅供研究不用于临床诊断

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