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Ni琼脂糖凝胶说明书
点击次数:54 发布时间:2020-02-24

Ni琼脂糖凝胶说明书

Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

目录号:  K0010       

保    存:  20%乙醇中          2-8℃保存 

 

组分说明 

 

                     Cat.No.        K0010A         K0010C

                     Volume           10ml         100ml

 

产品简介

该镍柱纯化系统对6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力,能够高效一步纯化带有6 个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4 个 Ni2+ 螯合位点,较只有3 个螯合位点的Ni-IDA 结合Ni2+更为牢固,有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His 标签蛋白的结合能力,提高纯化效率。较高的基团密度,大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下,对来源于各种表达系统(如杆状病毒,哺乳细胞,酵母以及细菌)中的 His 标签蛋白,均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子,可直接使用,方便,快捷。

支持物:CL-6B 琼脂糖凝胶

      载量:20-30mgHis标签蛋白/ml 填料

      粒径:50-160μm

 

注意事项 

 

 1. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT 和EDTA。

 2. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

 3. 为提高纯化效率,首先确定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的zui佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑(20-500mM)洗脱蛋白,并通过                SDS-PAGE 或 WesternBlotting 来检测目的蛋白的纯度。

 4. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液,并通过0.45µm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞,建议将裂解液进行离心,或者使用 0.45µm 过滤器过滤。

 5. 柱再生时,保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

 

操作步骤 

 

组装层析柱 

 1. 将填料混匀后加入层析柱,室温静置10 分钟,待凝胶与溶液分层后,把底部的出液口打开,让乙醇通过重力作用缓慢流出。

注意:(1)填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20-30mgHis标签蛋白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。

(2)如果乙醇不流出,可以给柱子一个外力,例如用大拇指对柱口轻轻按压一下,迫使乙醇流出。                                                        (3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。

2. 向装填好的柱中加入5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后,再用 10 倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子,平衡结束后即可上样。

 

     注意:柱体积指的是填料的体积。

 

I  可溶性蛋白的纯化(SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方详见附表1) 

 1.  收集菌体后,每100mg菌体(湿重)加入1-5 ml细菌裂解液,超声裂解菌体。

 2.  将菌体裂解液负载上柱,流速为10倍柱体积/小时。

 3.  使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子,收集流穿峰。

 4.  使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。

 5.  洗脱后,依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),4℃保存。

II  包涵体蛋白的纯化(InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方详见附表2) 

 1. 收集菌体后,每100mg菌体(湿重)加入1-5 ml  细菌裂解液,超声裂解菌体。

 2. 离心,弃上清,将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中(如有需要,可进行超声波处理,超声前可加入1-5mM磷酸酶抑制剂混合物)。

 3. 重复操作2,直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)。

 4. 将沉淀重悬于Inclusion BodyBinding Buffer中,冰浴1小时,使包涵体溶解。

 5. 10,000×g离心20分钟,将上清以孔径为0.45 μm的滤膜过滤。

 6. 将蛋白溶液负载上柱,流速为10倍柱体积/小时。

 7. 使用15倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer冲洗柱子,收集流穿峰。

 8. 使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。

 9. 洗脱后,依次使用3倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),4℃保存。

  注意:在纯化包涵体蛋白时,所有缓冲液均含有变性剂,需要降低BindingBuffer 中的咪唑浓度(5mM 或更低)。洗脱时,若蛋白在较高pH下洗脱失败,可以选用低 pH 缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5,pH5.9 或 pH4.5)。 柱再生当填料使用多次后,结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色),可以用以下方法再生,提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

 1. 使用2 倍柱体积的6M  盐酸胍冲洗后,使用3 倍柱体积的去离子水冲洗。

 2. 使用 1 倍柱体积2% SDS 冲洗。

 3. 依次使用 1 倍柱体积的25%、50%、75%和5 倍柱体积100%乙醇冲洗,再依次使用              1 倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。

 4. 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。

 5. 使用 5 倍柱体积含50 mM EDTA 缓冲液(PH8.0)冲洗。

 6. 使用 3 倍柱体积去离子水,3 倍柱体积20%乙醇冲洗。

 7. 4°C 保存。

 

 8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱体积去离子水冲洗,然后使用5 个柱体积的      50 mM NiSO4再生,3 个柱体积的Binding Buffer   平衡。

 1: 蛋白分子量标准  

(分子量由大到小分别为:90/66/45/27/  14.4kDa)

2: 全菌裂解液

 3: 流穿收集液

 4: 洗脱收集液    

1(洗脱缓冲液,含     500mM   咪唑,收集第1 个柱体积)

 5: 洗脱收集液

2(洗脱缓冲液,含 500mM 咪唑,收集第 2 个柱体积)

 6: 洗脱收集液

3(洗脱缓冲液,含500mM咪唑,收集第3 个柱体积)

7: 洗脱收集液

 4(洗脱缓冲液,含500mM 咪唑,收集第 4 个柱体积)

 

  

 附表 

 

 附表  1. 可溶性蛋白纯化缓冲液配方

                                                         

成分                    Tris-HCl(PH7.9)   咪唑             NaCl

 

SolubleBindingBuffer              20mM      10mM            0.5M

 

SolubleElutionBuffer              20mM        500mM           0.5M



 

    

 

 附表  2. 包涵体蛋白纯化缓冲液配方

 

成分                 Tris-HCl(PH7.9)       咪唑        NaCl     尿素/盐酸胍

 

InclusionBodyBindingBuffer        20mM           5mM       0.5M      8M/6M

InclusionBodyElutionBuffer        20mM          500mM       0.5M      8M/6M

 

    

 



 

 

                                                                                                                       

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