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过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒说明书

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详细介绍

过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒说明书

紫外分光光度法

测定意义:                           

CAT(EC 1。11。1。6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用

测定原理:

H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

自备的仪器和用品

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰蒸馏水

试剂组成和配制

提取液:60mL×1瓶,4℃保存

试剂一:60mL×1瓶,4℃保存

试剂二:100uL×3瓶,4℃保存。

粗酶液提取

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至240nm处,蒸馏水调零。

2、CAT检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二(100 uL)中加入20mL试剂一,充分混匀,作为工作液;用不完的试剂4℃保存一周;

3、测定前将CAT检测工作液37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min

4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中,再加入35μL样本,混匀室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2

CAT活性计算:

1、血清(浆)CAT活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反总÷ε×d)×109]÷V样÷T=678×ΔA

2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d)×109(W× V样÷V样总)÷T=678×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.356×ΔA

 

V反总:反应体系总体积,1.035×10-3 L;ε:H2O2摩尔消光系数,4.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.035 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 minW:样质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500万。

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