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考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

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详细介绍

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定,

确保蛋白浓度在0~1000µg/ml范围内。

测定意义

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外,可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理

在酸性溶液中,考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物;该复合物在595nm处有最大吸收峰, 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高,适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品

离心机、可见分光光度计、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

标准品:液体×1 瓶,4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取

1. 液体样品:澄清无色液体样品可以直接测定。

2. 组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入1mL提取液(自备,根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即待测液。(动物样品常常需要稀释)

3. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1. 分光光度计预热30min,蒸馏水调零。

2. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL蒸馏水,1000μL试剂一,混匀后室温静置10min,

于595nm比色,10~20min 完成比色,记为A空白管。

3. 标准管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL标准液,1000μL试剂一,混匀后室温静置10min,

于595nm比色,10~20min 完成比色,记为A标准管。

4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL待测液,1000μL试剂一,混匀后室温静置10min,

于595nm比色,10~20min完成比色,记为A测定管。

注意:空白管和标准管只需要测定一次。

 

 

 

 

计算公式:

Cpr(µg/mL)= C标准管×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

=50×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

C 标准管:标准品蛋白质浓度,50μg/mL。

注意事项:

1.加考马斯亮蓝后,在10~20min 内吸光值相对较稳定,因此须在10~20min 完成比色。

2.不宜用石英比色皿,可用玻璃或塑料比色皿,测完成后立即用 95%乙醇冲洗。

3.测定前用1~2个样做预实验,确保蛋白浓度在0~1000µg/ml 范围内,否则需要做相应稀释,使得稀释后的结果在 0~1000µg/ml 范围内,然后再乘以稀释倍数。

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