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超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒说明书

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详细介绍

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)试剂盒说明书

可见分光光度法

测定意义:

 

SODEC 1.15.1.1广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中催化超氧化物阴离子 发生岐化作用生成 H2O2 和 O2SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶也是 H2O2 主要生成 酶在生物抗氧化系统中具有重要作用。

 

测定原理:

 

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.)O2-.可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜后者在 560nm 处有吸收SOD 可清除 O2-.从而抑制了甲臜的形成反应液蓝色越深 说明 SOD 活性愈低反之活性越高。

 

需自备的仪器和用品:

 

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂的组成和配制:

 

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:15mL×1 瓶,4℃保存;

 

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存,用时加入27ml蒸馏水,充分摇匀悬浊液;

试剂三液体 175μL×1 支4℃保存(与蒸馏水1:1稀释再使用)

 

试剂四液体 10mL×1 瓶4℃保存。

 

粗酶液提取:

 

1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤

 

1、分光光度计预热 30min 以上调节波长至 560nm蒸馏水调零。

 

2、测定前将试剂一、二和四 37哺乳动物25其他物种水浴 5min 以上。

3、样本测定EP 管中依次加入下列试剂):

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

试剂名称μL

测定管

对照管

 

 

 

试剂一

240

240

 

 

 

试剂二

510

510

 

 

 

试剂三

6

6

 

 

 

样本

90

 

 

 

 

试剂四

180

180

 

 

 

蒸馏水

 

90

 

 

 

 

充分混匀室温静置 30min 后加入 1mL 玻璃比色皿560nm 处测定各管吸光值 A

注意事项:

 

1、试剂三为酶不可冷冻使用时在冰上放置。

 

2、对照管只需要做一管。

 

SOD 活性计算:

 

1、抑制百分率的计算

 

抑制百分率(A 对照管A 测定管) ÷A 对照管× 100%

 

尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高则需将样本用 提取液适当稀释如果测定出来的抑制百分率偏低则需重新准备浓度比较高的待测样本。 2SOD 酶活性单位在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为 50%反应体系 中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)

 

3SOD 酶活性计算

 

(1)血清(浆)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1抑制百分率)×V 反总]÷V ×样本稀释倍数=11.4×抑制百分率÷(1抑制百分率样本稀释倍数

 

(2)组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算:

a.按样本蛋白浓度计算

 

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1抑制百分率)×V 反总]÷(V ×Cpr)×样本稀释倍数

 

=11.4×抑制百分率÷(1抑制百分率)÷Cpr×样本稀释倍数 需要另外测定建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

b.按样本鲜重计算

 

SOD 活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1抑制百分率)×V 反总]÷(W×V ÷V 样总样本稀释 倍数=11.4×抑制百分率÷(1抑制百分率)÷W×样本稀释倍数

 

c.按细菌或细胞个数计算

 

SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1抑制百分率) ×V 反总]÷(500×V ÷V 样总样本稀释 倍数=0.0228×抑制百分率÷(1抑制百分率样本稀释倍数

 

V 反总反应体系总体积1.026mLV 加入反应体系中样本体积0.09mLV 样总 加入提取液体积1 mLCpr样本蛋白质浓度mg/mL W样本质量g500细胞或 细菌总数500 万

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