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ELISA直接法测长叶车前花叶病毒(RMV)含量实验步骤
发布时间:2014-01-16 点击次数:607次

ELISA直接法测长叶车前花叶病毒(RMV)含量实验步骤

 

  1. 将不同浓度的待检测RMV溶液作为样品液,在测定板每孔各加250ul,至冰箱(4)中孵育过一夜。
  2. 孵育后,去除孔穴内抗原溶液,用PBS-Tween20溶液缓缓冲洗孔穴3次,每次3min,然后去净洗涤液。
  3. 每孔穴加250ulRMV的酶标记抗体溶液(用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀释)在恒温箱(37)里孵育3-6h,6下过一夜。
  4. 去除孔穴酶标记抗体溶液,用PBS-Tween20溶液缓缓冲洗3次每次3min,然后去净洗涤液。
  5. 每孔穴加入新鲜配备的底物溶液250ul,室温放置0.5h,或者放置出现黄色。
  6. 加入50ul3N NaOH,终止反应。
  7. 对每孔穴的黄色溶液,测定449nm波长处的吸光值。

讨论

  1. 如该聚苯乙烯塑料微量反应板*次使用,应分别用标准浓度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV与它的IgG形成的免疫结合物,进行期盼滴定法来测该聚苯乙烯塑料微量反应板对RMV抗原和它的抗体的吸附能力。
  2. 在正式测样品前,用0。1mol/L pH9。6碳酸盐缓冲液配置各种标准浓度的RMV溶液,依照实验步骤测定RMV各种标准浓度的A449nm值,以病毒标准浓度为横坐标,A449nm值为纵坐标绘制标准曲线,由此可以测出RMV包被的zui适合浓度。
  3. 测出原始底物的吸光值,以便核准数据。
  4. 对照标准曲线,就可算出样品液中RMV的含量。
  5. 如无牛血清白蛋白,可用0.1%白明胶代替。
  6. 对于不稳定的病毒,用中性缓冲液稀释。
  7. 如有ELISA测定仪,可快速测定。

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