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氯霉素检测试剂盒说明书
更新时间:2019-08-19
型    号:
所属分类:(组织﹑尿样﹑血清)检测
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氯霉素检测试剂盒可得出相应残留物氯霉素的含量。氯霉素检测试剂盒说明书
本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法,在微孔条 上预包被偶联抗原,样本中的残留物氯霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体,加入 酶标记物后,用 TMB 底物显色,样本吸光值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出相应残留物氯霉素的含量。

氯霉素检测试剂盒说明书产品概述:

 

氯霉素快速检测试剂盒说明书

 

一、氯霉素检测试剂盒说明书原理

 

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法,在微孔条 上预包被偶联抗原,样本中的残留物氯霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体,加入 酶标记物后,用 TMB 底物显色,样本吸光值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出相应残留物氯霉素的含量。

 

二、试剂盒特性

 

试剂盒灵敏度:  0.05ppb

 

u 孵育温度:    25

 

u 孵育时间:    30min30min15min

 

  • 样本检测下限

 

蛋类、牛奶

(方法一)····························· 0.1 ppb 尿液、血清、肠衣、饲料、奶粉··················· 0.05ppb 组织、肝脏、蜂蜜、牛奶

(方法二)············· 0.025ppb

  • 交叉反应率

 

氯霉素·     ······································· 100%

 甲砜霉素  ······································ < 0。1%

 氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

 样本回收率

 

组织、肝脏 ································

85%±20%

蜂蜜、肠衣 ································

83%±25%

牛奶、饲料 ································

75%±23%

尿液、血清 ································

70%±18%

三、试剂盒组成

 

 

 

 

 

 

1

微量测试孔

每条 8 孔,一板 12 条

 

 

 

 

 

标准液×6 瓶

0ppb

0。05ppb

2

0.15ppb

0。45ppb

1ml/瓶)

 

1.35ppb

4.05ppb

 

 

 

 

 

 

3

酶标记物

12ml

红色帽

 

 

 

 

 

4

抗体浓缩液

1ml

蓝色帽

 

 

 

 

5

底物 A 液

7ml

白色帽

 

 

 

 

6

底物 B 液

7ml

黑色帽

 

 

 

 

7

终止液

7ml

黄色帽

 

 

 

 

8

20X 浓缩洗涤液

40ml

白色帽

 

 

 

 

9

2X 浓缩复溶液

50ml

透明帽

 

 

 

 

 

四、所用仪器、试剂

具备的仪器:酶标仪、均质器、振荡器、离心机、 刻度移液管、天平(感量 0.01g)、氮 吹仪、恒温箱

 

微量移液器:单道 20200µl、单道 1001000µl

多道 30300 µl

剂:乙酸乙酯、乙腈、亚硝基铁qing化钠、

葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)

硫酸锌、醋酸钠、正己烷、醋酸

五、样本前处理步骤

样本处理前须知

a)实验中必须使用一次性吸头,吸取不同试 剂时要更换吸头。

b)实验之前须检查各种实验器具是否干净, 必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实 验结果。

样本前处理需配制:

 

配液 1  C 液(牛奶、奶粉样本):

10。7g 亚硝基铁qing化钠加去离子水 100ml 溶解。

配液 2  D 液(牛奶、奶粉样本):

28.8g 硫酸锌加去离子水 100ml 溶解。 配液 3 pH4.8 100mM 醋酸钠缓冲液(尿样本):2.4g 醋酸钠和 1。2ml 醋酸加去离子水500ml 溶解混合。

 

配液 4 乙腈-水溶液:

 

V 乙腈VH2O8416

 

配液 5 样本复溶液:2X 浓缩复溶液用去离子水按 11 稀释。

 

 

(1 份浓缩复溶掖+1 份去离子水,用于抗体

氮气流下干燥;用 0。5ml 样本复溶液溶解干燥

 

的稀释和样本提取后的复溶)。

的残留物,混合 30s

u

样本处理:

3、 取 50 µl 用于分析。

 

a)组织、肝脏样本处理方法

样本稀释倍数: 0。5 倍

1、 称取均质后的样本 3±0。05g  50ml 离心管中,

检测下限:0.025ppb

定量下限:0.1 ppb

 

先加入 3ml 去离子水混匀后再加入 6ml 乙酸乙

注:我们推荐 0.1 ppb 为阳性样本的 cut off 值。

 

酯,振荡 2min,室温 4000r/min 以上离心 10min

e)肠衣处理方法

 

2、 取出 4ml 上层液体在 50-60℃氮气流中吹干;

1、 用均质器均质样本;注:干样本需剪碎(长度

3、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的残留物,再加 1ml

不超 5mm)后再均质,湿样本需用去离子水漂

 

样本复溶液混合 30s,室温 4000r/min 以上离心

20min 以上去除表面的盐份,沥干后再均质;

 

5min;去除上层有机相;

2、 称 1±0.05g 均质后的样本于 50ml 离心管中,加

4、 取 50 µl 下层相用于分析。

10ml 乙酸乙酯,振荡 2min,室温 4000r/min

 

样本稀释倍数:  0.5 倍

以上离心 10min

 

b)血清血浆处理方法

3、 取 5ml 上层液体(相当于 0.5g 的样本)在氮气

1、 取 1ml 血清或血浆至试管中,加 2ml 乙酸乙酯

流下 50-60℃干燥;

 

 

振荡 1min;静置使水相与有机相分层或室温

4、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的残留物,再加 0.5ml

 

4000r/min 离心 5min

样本复溶液振荡混合 30s,室温 4000r/min 以上

2、 移取上层的乙酸乙酯至另一试管中,用氮气流

离心 5min;除上层有机相;

 

50℃水浴中干燥;残留物用 1 ml 样本复溶液溶

5、 取下层 50 µl 用于分析。

 

解,混合 30s

样本稀释倍数: 1 倍

 

3、 取 50 µl 下层相用于分析。

f)牛奶样本处理方法一

 

 

样本稀释倍数:  1 倍

1、 将牛奶样本 104000r/min 以上离心 10min

c) 尿液处理方法

理,吸除上层脂肪;然后取 5ml 去除脂肪奶样

1、 移取 2ml 尿液到离心管中,加 pH4。8 100mM

50ml 离心管中,加入 150µl C 液出现沉淀,

 

酸钠缓冲液 0.5ml 混合;加 40µl 葡萄糖苷酸酶

短暂振荡后加入 150µl D 液混合;

 

(Merck,Art。No。4114)到稀释的尿液中,在 37

2 154000r/min 以上离心 10min,移取上层液;

 

水解至少 2 小时(或过夜);

用样本复溶液以等体积稀释上层液,混合 30s

2、 该溶液恢复至室温后加入 8ml 乙酸乙酯混合

3、 取 50µl 用于分析。

 

 

1min;室温 4000r/min 离心 10min,取出 4ml

注:如果离心后仍然浑浊,再重复沉淀过程。

 

上层液体在氮气下 5060℃干燥;

样本稀释倍数:2

 

3、 用 1ml 样本复溶液溶解干燥的残留物,混合

检测下限:0.1ppb

定量下限:0.15ppb

 

30s

g)牛奶样本处理方法二

 

4、 取 50µl 用于分析。

1、 将牛奶样本 104000r/min 以上离心 10min

 

样本稀释倍数:  1 倍

理,吸除上层脂肪;然后取 5ml 去除脂肪奶样

d)蜂蜜处理方法

50ml 离心管中,加入 250µl C 液和 250µl D

1、 取 2±0.05 g 蜂蜜,放入离心管中,用 4ml 去离

液彻底混合,4-124000r/min 以上离心 10min

 

子水溶解;加入 4ml 乙酸乙酯振荡 2min,室温

如无冷冻离心机,将样本置冰箱中冷却到 8℃;

 

4000r/min 以上离心 10min

2、 转移出 2.2ml 上层液(相当于 2ml 奶样)至新

2、 移取 2ml 上层清澈液到另一离心管中,50-60

的离心管中,加入 4ml 乙酸乙酯上振荡 2min

 

室温(20-25℃)4000r/min 以上离心 10min ; 3、 吸取2ml 乙酸乙酯上层液体(相当于1ml 奶样),

50-60℃氮气流下完全干燥;用 0.5ml 样本复溶 液溶解干燥的残留物,混合 30s

4、 取 50µl 用于分析。

样本稀释倍数:0.5

检测下限:0。025ppb     定量检测限:0.05ppb

由于阴性样本可能会产生背景干扰 (在某些 情况下干扰数值在标准 2 到 3 之间),所以推 荐标准 3 作为阳性结果的 CUT OFF 判断值。

h)奶粉样本处理方法

1、 称 2±0.05 g 奶粉至 50ml 离心管中,加入 10ml去离子水振荡溶解;加入 1ml C 液和 1ml D 液彻底混合;4-124000r/min 以上离心 10min若无冷冻离心机,请预先将样本冷却到 8℃;

2、 转移出 3.6ml 上层液(相当于 0.6g 奶粉)至新 的离心管中,加入 6ml 乙酸乙酯振荡 5min;室 温(20-25℃)4000r/min 以上离心 10min

3、 吸取 4ml 乙酸乙酯上层液体(相当于 0。4g  粉),50-60℃氮气流下完全干燥;用 0。4ml 样本复溶液溶解干燥的残留物,混合 30s

4、 取 50 µl 用于分析。

样本稀释倍数:1

检测下限:0。05ppb      定量检测限:0.15ppb

由于阴性样本可能会产生背景干扰 (在某些情况下干扰数值在标准 2 到 3 之间),所以推荐 标准 3 作为阳性结果的 CUT OFF 判断值。

i)蛋类处理方法

1、 称取 3±0。05 g 均质的样本,加入 9ml 乙腈-水溶 液振荡 2min,154000r/min 以上离心 10min

2、 取 3ml 上层相与 3ml 去离子水水混合,加入4.5ml 乙酸乙酯,混合 1min,154000r/min 上离心 10min;取上层有机相置 50-60℃下氮气 流吹干;

3、 加入 1ml 正己烷溶解残留物后,用 2ml 样本复 溶液混合 30s,室温 4000r/min 以上离心 5min去除上层有机相;

4、 取 50 µl 用于分析。

 

样本稀释倍数:

 

检测下限:0.1ppb

定量检测限:0。3ppb

7、 将孔内液体甩干,用已稀释的洗涤液 250µl/

j)饲料处理方法

 

洗板 45 次,每次间隔 1530 秒,用吸水纸

1、 称取 2±0。05g 均质过的饲料样本,加入 2ml

拍干(拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺

 

离子水,再加入 6ml 乙酸乙酯,充分振荡 2min

破)。

 

 

 

15 4000r/min 以上离心 10min

8、 每孔加入酶标记物100µl,盖板膜盖板后置25

2、 取 3ml 上层有机相到试管中 56℃下氮气吹干;

环境中反应 30min。将孔内液体甩干,用洗涤

3、 加入 1ml 正己烷溶解残留物,用 1ml 样本复溶

液充分洗,45 遍(同上),用吸水纸拍干(拍

 

液混合 30s,室温 4000r/min 以上离心 5min;去

干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

 

除上层有机相;

 

9、 显色:加入底物 A  50µl/孔,再加入底物 B

4、 取 50 µl 用于分析。

 

50µl/孔,轻轻振荡混匀,25℃环境中避光显

 

样本稀释倍数:1

 

15min

 

 

六、 酶标免疫分析程序:

 

10、 测定:加入终止液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,

 

设定酶标仪于 450nm 处(建议用双波长 450/63

u

测定前应须知:

 

 

0nm 检测,5min 内读数),测定每孔 OD 值。

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温

 

 

 

 

2025℃)。

 

七、结果判定

 

 

2、 使用之后立即将所有试剂放回 28℃。

结果判定有两种方法,粗略判定可用第 1 种方

3、 在 ELISA 分析中的再现性,很大程度上取决于

法,定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与

 

洗板的一致性,正确的洗板操作是 ELISA 测定

其所含氯霉素量成负相关。

 

 

程序中的要点。

 

1、粗略判定:

 

 

4、 所有恒温孵育过程,避免光线照射,用盖板膜

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出

 

盖住微孔板。

 

其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0。3

u

操作步骤:

 

样本 2 的吸光度值为 1。0,标准液吸光度值分别是:

1、 从 28℃冷藏环境中取出所需试剂,室温(20

0ppb  2.2430.05ppb  1.8160。15ppb  1.415

 

25℃)平衡 30min 以上,注意每种液体试剂使

0。45ppb  0.741.35ppb  0.3134。05ppb  0.155

 

用前均须摇匀。

 

则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb4.05ppb;样本 2

2、 取出框架及需要数量的微孔,将不用的微孔放

的浓度范围是 0。15ppb0。45ppb,乘以其对应的

 

入自封袋,保存于 2-8℃。

释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

3、 配液:将 40ml 浓缩洗涤液(20 倍浓缩)用去

2、定量分析

 

 

 

离子水按照 119 稀释(1 份浓缩洗涤液+19 份

1)百分吸光率的计算,标准品或样本的百分

 

去离子水),或按所需用量配制洗涤液。

吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双

4、 编号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每

孔)除以第一个标准(0 标准)的吸光度值,再乘

 

个样本和标准品做 2 孔平行,并记录标准孔和

100%,即

 

 

 

样本孔所在的位置。

 

 

B

 

5 将浓缩抗体用样本复溶液 11 倍稀释(1 份抗体

百分吸光率(%)=

×100%

 

 

加入 10 份稀释液,按需配制使用)

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

6、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中,然后加

B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

加入抗体工作液 50µl/孔,用盖板膜封板,轻轻

2)标准曲线的绘制与计算

振荡混匀。25℃环境中反应 30min

 

 

以标准品百分吸光率为纵坐标,以氯霉素标准

 

品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线 图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准 曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释 倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

 

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于 大量样本的准确、快速分析。

八、 注意事项

1、 室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温(2025℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会 伴随着标准曲线不成线性,重复性不好的现象。 所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为 2M 硫酸,避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒;稀释或搀杂 使用会引起灵敏度、OD 值变化;不要交换使用 不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封;标准物质 和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴 露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。标 准品 1 的吸光度值小于 0.5 时,表示试剂可能 变质。

8、 该试剂盒zui佳反应温度为 25℃,温度过高或过 低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、 储藏条件:试剂盒于 2-8℃保存,不要冷冻。

2、 保 质 期:该产品有效期为 1 年,生产日期见 包装盒。

提示:酶标板真空包装袋若有漏气,酶标板仍然正 常有效,不影响实验结果,请放心使用。

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